Les techniques d'étude (II) : la cytogénétique moléculaire

1. Principe de la technique
2. Différents types de sondes sont utilisées
3. Principales applications de l'hybridation in situ

La cytogénétique moléculaire constitue une utilisation de la spécificité de l'appariement base à base de la molécule d' ADN pour identifier précisément un chromosome entier ou même un simple fragment.

1) Principe de la technique

Le principe repose sur l'utilisation d'une sonde moléculaire, c'est-à-dire une petite séquence d'ADN (ou d' ARN ) dont l'emplacement normal est connu dans le génome et qui est marquée chimiquement de façon à pouvoir être repérée par la suite. Cette sonde est mise en contact avec les chromosomes d'une mitose (ou de noyaux interphasiques) et va s'hybrider (se fixer) spécifiquement au niveau de sa séquence complémentaire. On peut alors visualiser la sonde au microscope dont l'emplacement identifie précisément la région chromosomique dont elle est complémentaire.

Les sondes sont marquées soit avec une molécule fluorescente, soit avec un haptène (molécule qui peut être reconnue par un anticorps). Dans le premier cas, la sonde est directement visible au microscope à fluorescence, tandis que dans le second, une étape supplémentaire de révélation avec un anticorps fluorescent est nécessaire.

2) Différents types de sondes sont utilisées :   

Sondes centromériques : elles s'hybrident au niveau des centromères des chromosomes. Les séquences dont elles sont complémentaires sont naturellement présentes en un grand nombre d'exemplaires au niveau des centromères ; le signal obtenu est donc en général intense car la sonde s'hybride sur chacune des séquences complémentaires présentes. Ces sondes sont surtout utiles pour dénombrer les chromosomes, aussi bien en métaphase qu'en interphase et pour identifier l'origine de chromosomes marqueurs .

Sondes de peinture chromosomique : elles sont constituées d'un ensemble de sondes de petite taille qui couvrent l'ensemble du chromosome. Ces sondes sont obtenues après isolement et marquage de l'ADN d'un chromosome ; leur réalisation ne nécessite pas de connaître la séquence de cet ADN. Après hybridation , on observe un marquage de tout le chromosome. Il existe également des peintures spécifiques d'un bras ou même de quelques bandes chromosomiques. Ces sondes sont très utiles pour interpréter certaines translocations complexes, mettre en évidence des échanges de petite taille, identifier précisément l'origine d'un fragment non identifié.

Sondes locus spécifique : comme leur nom l'indique, ces sondes de petite taille permettent d'identifier une région très précise du génome. Elles sont obtenues par marquage de l'ADN cloné dans différents vecteurs (plasmides, cosmides, YACS, BACs...). Leur intérêt principal réside dans la mise en évidence rapide de remaniements impliquant une région chromosomique précise ( microdélétions , translocations, inversions ...)

Ces sondes peuvent être employées seules ou être combinées entre elles pour obtenir un marquage multicouleur permettant une interprétation plus aisée de certains remaniements.

3) Principales applications de l'hybridation in situ
( FISH pour les anglo-saxons : Fluorescence In Situ Hybridisation) :

Dénombrement de chromosomes : mise en évidence d'anomalie de nombre des chromosomes, homogènes ou en mosaïque. +

Identification de l'origine d'un fragment chromosomique : chromosomes marqueurs, matériel supplémentaire d'origine inconnue sur un chromosome, remaniement complexes ou de toute petite taille. +

Mise en évidence de microdélétions, non vues sur le caryotype standard. +