Etude de la méthylation par clonage et séquençage

Cette technique a été la première qui a permis d'étudier en détail l'état de méthylation de tous les doublets CG d'une région donnée, mais sa lourdeur de mise en oeuvre la réserve à des projets de recherche.

Le principe repose sur l'isolement dans des bactéries (= clonage) des produits de PCR obtenus après amplification de l'ADN bisulphité. On a ainsi dans chaque bactérie un seul fragment de PCR qu'il sera facile d'analyser après amplification par culture bactérienne car on ne sera plus gêné par le mélange de brins de profil de méthylation différents. Cette analyse consiste en un séquençage du fragment inséré dans la bactérie. Par comparaison avec la séquence d'origine, il est facile de vérifier au niveau des doublets CG si on le brin examiné a conservé une C (donc ce site était initialement méthylé) ou si il présente une T (signe que ce site était déméthylé). En plus de l'information sur l'état de méthylation de tous les CG, on a également une information sur l'haplotype épigénétique, c'est à dire la répartition des doublets CG méthylés et déméthylés sur les deux allèles (est ce que tous les CG méthylés sont sur le même allèle ou sont ils répartis de manière aléatoire sur les deux brins ?)

La difficulté de mise en oeuvre de cette technique vient du fait que pour avoir une représentation correcte de l'état de méthylation des différentes molécules d'ADN présentes dans l'échantillon initial, il faut analyser plusieurs clones bactériens (au minimum 20, et plus on en analyse, meilleure est la représentation statistique), ce qui représente rapidement une quantité de travail très importante. De ce fait, cette technique n'est par utilisable pour un screening d'une grande population d'individus.