Etude de la méthylation par DHPLC
La DHPLC (Chromatographie liquide à haute pression en condition dénaturante) est une méthode qui donne un aperçu global de la méthylation d'une région. Son principe repose sur la séparation en conditions dénaturantes des produits PCR obtenus après traitement au Bisulphite de Sodium en fonction de leur affinité.
Après la PCR, les produits sont dénaturés (les deux brins de l'ADN sont séparés). Puis, on laisse les brins se réapparier entre eux. Trois types de réappariements sont possibles :
des homoduplex (appariement entre deux brins identiques) correspondants aux brins déméthylés (donc avec un T à la place du C au niveau du CG) ;
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des homoduplex correspondants aux brins méthylés (avec un C au niveau du CG) ;
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des hétéroduplex (appariements entre deux brins légèrement différents) correspondants à l'hybridation d'un brin porteur d'un T avec un brin porteur d'un C.
La séparation de ces hybrides se fait dans une colonne de chromatographie en conditions dénaturantes. Les brins vont donc être relargués de la colonne d'autant plus vite qu'ils sont moins stables. Ainsi, les hétéroduplex sont libérés les premiers (le mauvais appariement entraîne une instabilité), puis les homoduplex correspondants aux brins déméthylés (la liaison T-A ne possède que deux ponts Hydrogène) et enfin les homoduplex correspondants aux brins méthylés (la liaison C-G possède trois ponts Hydrogène). A chaque libération, on obtient un pic sur la courbe finale. Entre les deux pics Méthylé et Déméthylé, on peut dans certains échantillons observer une libération d'ADN qui correspond aux situations de méthylation partielle (tous les CG ne sont pas méthylés et donc plus ce nombre est important, plus la libération sera tardive).
Cette technique apporte donc une vue globale de la méthylaation d'une région, mais surtout elle permet éventuellement de distinguer deux allèles différentiellement méthylés : dans ce cas, on observe un pic au niveau des homoduplex déméthylés et un autre au niveau des homoduplex méthylés.
