Etude de la méthylation par PCR

Une fois traité par le Bisulphite de Sodium, la méthode la plus simple pour rechercher la présence d'une C ou d'une T est d'utiliser la PCR. Cette technique est rapide, elle peut être automatisée et donc autorise l'analyse d'un grand nombre d'échantillons. Ce pendant, un seul CG est examiné à chaque fois.

Deux approches sont possibles :

  1. soit la transformation par le Bisulphite de Sodium crée un site de restriction sur l'un des brins et pas l'autre (sur le brin méthylé dans l'exemple ci-contre); dans ce cas, après amplification de l'ADN bisulphité par PCR avec des amorces situées de part et d'autre du site de restriction, on vérifie par l'enzyme de restriction correspondante la présence ou non de ce site. Dans l'exemple choisi, si l'enzyme coupe le produit PCR, c'est que le CG était initialement méthylé; si elle ne coupe pas, c'est que le CG était déméthylé.

  2. si aucun site de restriction n'est créé (ou si on veut s'affranchir de cette contrainte), on peut utiliser des amorces dont la dernière base en 3' est complémentaire soit d'un C, soit d'un T. Si l'ADN éétait méthylé, seule l'amorce spécifique du C donnera un produit PCR, alors que si le CG était déméthylé c'est l'amorce complémentaire du T qui donnera une amplification. Ce système permet ainsi de mettre en évidence une perte d'empreinte par comparaison des résultats obtenus avec les deux amorces chez un patient et chez des témoins.